细胞培养用液的配制

【实验目的】
1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制
2. 学习针头滤器的使用方法
【实验原理】
一.细胞培养的基本条件
1. 气体环境
    气体是细胞生存的必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环,产生能量和合成各种成分。二氧化碳主要维持培养基的pH,并作为碳源。一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。氧分压过大,不利于细胞生长。植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。
2. pH环境
    细胞生长的pH环境为:7.2-7.4,不同细胞有所差异。一般细胞耐酸性比耐碱性大些。         CO2对培养基pH的影响: CO2是细胞的代谢产物, CO2的释放必然会影响培养基 的pH。
CO2 + H2O     H2CO3    H+ + HCO3-
    所以,培养基中要加一些缓冲剂,以保持 pH的稳定,如 NaHCO3 、HEPES等
3. 糖类
葡萄糖------细胞的主要营养物质,为生命活动提供能量
糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量,与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。
体外培养动物细胞时,几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料,根据不同细胞的代谢特点,所加葡萄糖浓度有所不同。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。
4.氨基酸
       所有细胞多需要以下12种氨基酸:精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸        另外所有细胞都需要谷氨酰胺,其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜,参与核酸合成,也是能源和碳源。
5.维生素
   在细胞代谢中起调节作用,虽然所需甚微,但为机体正常代谢不可缺少。
6.促生长因子
   培养基中除上述营养成分外,还需要促细胞生长因子,已知有许多激素具有促细胞增殖作用。
   血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。
二.天然培养基与合成培养基
1.天然培养基
 常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)、鼠尾胶原等。
优点: 营养成分丰富,培养效果好
缺点: 来源受限。
       成分复杂,影响某些实验产物的提取和结果的分析                          
       易发生支原体污染
2.合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如DMEM、 RPMI-1640、 TC199、MEM等。       
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
    优点:标准化生产,组分和含量相对固定。成本低
    缺点:缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。
培养基的主要种类(基础培养基):
    单纯的基础人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长 和繁殖,还需补充一定量的天然培养基
完全培养基的组成
     基础培养基                     80%一95%
     血清                           5%一20%
     碳酸氢钠                       2.0 g/L
     青、链霉素                     各100单位/毫升
血清的功能:提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子,有一定的保护作用无血清培养基
三,消化液
1.胰酶溶液:0.1-0.25% ,pH一般在8左右 ,受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。                                              
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25% 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
2.EDTA溶液:解离细胞,0.02%,可以和胰酶混合使用