细胞培养过程中的污染

细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物,而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质,包括生物和化学物质。
培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,**后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。
  培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但**后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
  支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的**小微生物,**小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性,多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
  培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。
  采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
五、非同种细胞污染
  由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的,而现在却认为是HeLa细胞。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。
  非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。
第二节污染来源及鉴别
一、污染来源
  细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径。
  1、不洁的动物组织标本
  很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外),但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌,如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡,也会带菌,造成细胞污染。
  2、空气
  空气中含有大量的微生物,如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,净化工作台使用过久,滤板未定期更换或长久不更换,滤气受尘埃堵塞,工作时不带口罩或外界气流过强,污染空气进入操作区,也会导致污染。春夏季南方地区多雨,空气湿度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。
  3、清洗消毒
  培养用物品、材料洗刷不净,培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。
  4、操作
  来自操作者的污染主要有以下几方面:
  器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过,或者是否已经消毒灭菌处理过,或者虽经处理,时隔已久又末重新处理。
  操作者未戴口罩、帽子,呼出气中排出细菌和支原体。
  培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。
  操作者不当心,动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品,如手上皮肤和瓶子外壁等。
  操作者操作时大声说话,来回走动扬起灰尘等。
  5、血清
  市售血清灭菌不彻底,潜在病毒和支原体污染。
二、污染的鉴别
  (一)细菌、真菌污染的检测
  1.肉眼观察
  细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。
  2.镜下观察
  在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
  3.接种观察
  采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染。
(二)支原体污染的检测
1.相差显微镜观察
  将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。