细菌内毒素检测标准操作程序

1.0目标

制定程序是为细菌内毒素测试提供指导。

2.0范围

此程序适用于细菌内毒素测试。

3.0责任

微生物学家

4.0问责制

质量检查和质量控制主管

5.0程序

5.1总则

5.1.1清洁所有必需的玻璃器皿,并按照SOP进行去热原,以便对玻璃器皿进行去热原。
5.1.2将所有无热原玻璃器皿转移到BET室。
5.1.3开关“ON”加热块按照操作用于指令的SOP 加热块,并在37设定的温度°C
5.1.4 MVD计算为下述式样品试样-
MVD计算
5.1.5用LRW将待测样品稀释至四分之一MVD,并在涡旋振荡器上振荡3分钟。
5.1.6注射用水的取样和测试:按照取样计划,将注射用水样品收集在去热原的小瓶或试管中。注射用水应  根据分析方法进行测试。

5.2制定控制标准(CSE)

5.2.1按照制造商提供的瓶子和制造商提供的说明中的说明重新配制LRW中的CSE,并间歇涡旋30分钟。
5.2.2重构后4周内使用重构后的CSE。
5.2.3用LRW制备CSE稀释液以产生1EU / ml,并在涡旋中摇动稀释液3分钟。
5.2.4通过稀释体积制备4λ,相当于从1 EU / ml到LRW的4λ浓度。将稀释液在漩涡中摇动3分钟。(4λ由l浓度反算,即λ是裂解物的灵敏度)。

5.3裂解液的重建

5.3.1现在,在无菌刀片的帮助下,通过打开裂解液的铝质封口来重新配制裂解液。
5.3.2通过在坚硬的表面上敲击,将裂解物粉末收集到样品瓶的底部。然后慢慢打开软木塞。
5.3.3按照制造商的说明,在使用前添加LRW或缓冲溶液,并立即更换软木塞。

5.4标记的裂解液敏感性的确认

5.4.1重复四次确认,然后在测试中使用裂解物溶液的标记灵敏度λ,以EU / ml或IU / ml表示。当使用新一批的裂解物或实验条件发生任何变化而可能影响测试结果时,**进行裂解物敏感性的确认。
5.4.2通过将一系列CSE溶液用水稀释成BET(LRW),用至少四种等于2λ,λ0.5λ和0.25λ的浓度的4λ溶液制备CSE稀释液。
5.4.3取10个去热原化验管,并通过编号对管进行标记并将其一式四份排列在架子上,然后按照下表进行操作-
稀释
5.4.4分别将100 ml稀释的CSE(即分别为2λ,λ,0.5λ和0.25λ)移入去热原的试管(10 mm x 75 mm)中,并进行相应标记。对于NWC(负水控制),请分别使用100 ml LRW,并一式四份进行测试。
5.4.5在每个试管中加入100毫升重构的裂解液,并轻轻混合。
5.4.6将反应混合物在37°±1°下恒温孵育60±2分钟,避免振动。
5.4.7孵育后,取每个试管,直接从培养箱中转过来,以一个平稳的动作将其翻转大约180°。如果形成了牢固的凝胶,该凝胶在反演后仍保留在原位,则记录结果为阳性。如果未形成完整的凝胶,则结果为阴性。
5.4.8除非**低浓度的标准溶液在所有重复测试中均显示阴性结果,否则该测试无效。
5.4.9终点是内毒素浓度下降系列中的**后一个阳性结果。使用以下表达式计算终点浓度的对数平均值,然后计算平均值的对数:
几何平均数
5.4.10几何平均终点浓度是裂解物溶液的测量灵敏度(EU / ml或IU / ml)。如果其不小于0.5λ且不大于2λ,则确认标记的灵敏度并将其用于用该裂解物进行的测试中。

5.5测试程序

5.5.1如表1,
表– 1 所示制备溶液A,B,C和D
5.5.2取8根去热原的化验管并编号,并在对置的架子上进行标记。例如,NPC为1&2,PPC为3&4,PWC为5&6,负水控制为7&8。
5.5.3在NPC和PWC中加入50毫升LRW,在NWC中加入100毫升。立即添加50 ml产品样品,将其在NPC和PPC中以MVD / 4稀释,然后添加50ml CSE,将其在PPC和PWC中稀释至4λ。
5.5.4**后在所有试管中加入100 ml裂解液,然后用手混合测定管并在加热块中孵育,在加热块中将温度保持在37±1°C保持60±2分钟。

5.6结果解释

5.6.1凝胶凝块法中的每个试管均被解释为阳性或阴性,阳性试验表明形成牢固的凝胶,当试管倒置180°时能够保持其完整性。
5.6.2阴性测试的特征是不存在凝胶或形成粘性物质,当试管在180°倒置时粘性物质不起作用。
5.6.3除非两个阳性对照溶液B和C的两个重复均为阳性,而阴性对照溶液D的两个重复均为阴性,否则该测试无效。
5.6.4当溶液A的两个重复均发现阴性结果时,所检查的制剂符合测试要求
。5.6.5溶液A的两个重复均发现阳性结果时,则不符合测试要求。
5.6.6如果溶液A的一个重复试验发现阳性结果,而另一溶液的阴性结果重复试验。如果在重复测试中溶液A的两次重复均发现阴性结果,则所检查的制剂符合测试要求。

5.7故障调查

5.7.1当在两个测试准备试管上都观察到阳性结果时,通过检查以下参数来调查其失败的原因。
5.7.2检查产品稀释度,CSE稀释度和裂解物稀释度。
5.7.3是否按照SOP对玻璃器皿进行了清洁和去热原处理。
5.7.4检查裂解液批次和匹配的CSE的敏感性报告。
5.7.5检查加热块温度和校准。
5.7.6检查微量移液器校准。
5.7.7检查是否有微生物学家污染。

5.8注意事项

5.8.1复水的CSE可以在2至8°C下保存28天。
5.8.2提供的COA专门用于裂解液批次和CSE批次。因此,使用相同的批次进行测试
5.8.3请勿涡旋裂解液。

5.9频率

5.9.1裂解物敏感性的确认–每批货物。
5.9.2按照注射用水抽样计划。
5.9.3成品和原材料按批次进行。

6.0缩写

SOP:标准操作程序
QA:质量保证
QC:质量控制
NA:不适用
BET:细菌内毒素测试
CSE:对照标准内毒素
MVD:**大有效稀释液
LRW:Lal试剂水
PPC:阳性产品对照
NPC:阴性产品对照
PWC:阳性水控制
NWC:负水控制