小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

【实验目的】
1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法,并对小鼠脾细胞进行原代培养;
2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用;
3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法;
4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数;
【实验原理】
1.细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下,把动、植物细胞从组织中取出,在体外模拟体内的生理环境,使离体的细胞在体外生长和繁殖,并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞,在无菌条件下,用胰蛋白酶消化或机械分散等方法,将动物组织分散成单个细胞开始**培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度,形成致密的单层细胞时,用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞,从一个容器中以1:2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法,称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究,则要方便和简单得多。被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料,对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律,探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制,也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性,使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段,被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义
具有其他生物技术无可比拟的优点;培养条件易改变和控制,便于单因子分析;便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察;在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。
细胞培养的局限性:在脱离机体复杂环境下,细胞培养条件与躯体环境有一定距离;观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况;细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境,**适温度、渗透压、气体条件、**适PH、营养条件和培养基质等。
2.细胞死活鉴定
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异:
①细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性地通过;而细胞死后,细胞膜受损,其通透性增加。基于此,发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法,上述染料能使死亡细胞着色,而活细胞不被着色。此外,应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性,死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏,故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
②代谢上的差异:活细胞中新陈代谢作用强,细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此,发展处了以荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法,上述酯化的荧光素亲脂性提高,容易被细胞吸收进入,活细胞内的酯酶具有较强的活性,可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素,该物质不能自由透过活的细胞膜,积累在细胞内,荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光;而死亡细胞内的酯酶因失去活性,不能分解酯化的荧光素,荧光显微镜下显示不发光。另外,可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力,能使亚甲蓝从蓝色的氧化型
变成无色的还原型,故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色;死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞,因无还原能力或还原能力极弱,使亚甲蓝仍处于氧化态,故呈现蓝色或淡蓝色。
3.血球计数板的使用
血球计数板是一块特制的厚载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个方格网如图(3)。每个方格网共分
9大格,其中间的一大格又称为计数常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种:一种是大方格分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个大方格分成25
个中方格,而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即每个大方格都由400个小方格组成(图4)每个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1mm2每个小方格的面积为1/400mm2,盖上盖玻片后,盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm,所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板直接计数时,先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。