ES 细胞培养

ES 细胞培养

A.FBS的灭活与分装
1.化冻
将血清(Fetal Bovine Serum,Hyclone)从-20℃冰箱取出,放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻,化冻后若不马上灭活,可以放入4℃冰箱暂时保存;
 
2.灭活
 
(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶,插入一根温度计,温度监控以此为准);
(2) 当温度计显示56℃时,控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃,则:若仍未超过60℃,且时间很短(比如:不超过5分钟),则仍可使用;若超过60℃,或者时间较长,则弃去不用,或者尝试用于ME细胞的培养;
(2) 取出,自然冷却**室温(约需1-3小时),可分装或-20℃继续冻存;
 
3.分装
 
(1)转入细胞间,用移液器将血清分装,注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意:不要吹出气泡(血清很粘稠,很容易产生气泡;如果已产生气泡,则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;
(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。
 
B. 配制DMEM血清培养基
1.提前**将分装好的FBS从—20℃冰箱取出,放于4℃冰箱化冻;
2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如,丙酮酸钠、抗生素等),按照比例加入DMEM培养基中,作好标签;放入4℃冰箱保存。
配制比例如下:
 

50ml体积的干细胞培养液配制

 

 

DMEM(High glucose)/ DMEM培养基(高糖

 

 

谷氨酰胺()

50ul

 

非必需氨基酸

500ul

 

丙酮酸钠

500ul

 

B-巯基乙醇

??

 

双抗

50ul

 

血清

7.5ml

 

LIF

5ul

 

 

 

 

C.原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备
1. 取12.5-13.5dpc孕鼠,断颈处死;
2. 将鼠腹面向上放置,70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬,污染内脏及子宫),剪开皮肤层、肌肉层,打开腹腔,将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去,将子宫取出,转入无菌10cm平皿中;
3. 把平皿转入超净台;
4. 用镊子打开子宫壁,挤出鼠胚,并与胚外组织、胎盘等分离,除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);
5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿,用PBS洗三次;
6. 弃去PBS,用弯头剪将鼠胚剪碎,加入PBS洗**溶液基本无色(1-4次);
7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520,下同),体积约等于组织块体积;
8. 用滴管轻轻吹匀,室温下消化1-10分钟(或消化**溶液浑浊变粘),加入与消化液等体积培养基,轻轻吹打混匀(5-10次),静置;
9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出,转入离心管中。
10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);
11. 弃去上清,向沉淀中加入适量培养基,轻轻吹打重悬,将其分种**10 cm细胞培养皿,补加适量培养基,作标签(ME-0;注意:若冻存,则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则**好不用0代ME细胞做Feeder,要传到一代以后再用来制作Feeder比较好),转入培养箱培养;
12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次),若细胞已长满,则冻存,或者1:3-5传代(视细胞疏密而定),放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
 
饲养层细胞(Feeder)的制备
注:含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL,Calbiochem)