细胞培养之细胞计数

实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作
一.准备工作:
   取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备:
   用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数:
   1.取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
   2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑。活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
  3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
  4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
  5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:
细胞悬液的细胞数/ml=(四个大格子细胞数/4)×2×104
说明:/4因为计数了4个大格的细胞数;×2因细胞悬液:染液=1:1稀释;×104因为计数板中每一个大格的体积为:1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3  
四.细胞计数要点:
  1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中; 
  2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
  3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
  4.数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
  5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误:
  1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
  2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
  3. 滴入悬液时的量太多,**使细胞悬液流入旁边的槽中。 
六.本实验特殊试剂的配制:
4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水**100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用液:使用时,用PBS稀释母液**0.4%即可。
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。
2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。 
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 
4.置于液氮罐中长期保存。  
5同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。  
注意事项:
1.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构,以**于降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时**好戴上手套操作。 
2.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。
简便方法:
胰蛋白酶液消化>>离心>>PBS液1ml洗涤,吹打制成待测细胞悬液>>取1ul悬液+9ulPBS>>细胞计数:
1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.用10ul枪头将细胞悬液注入计数板,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
3.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)的细胞数目。
4.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:

(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×106