细胞培养技术重点Summary

一、名词解释
1、 细胞培养技术: 指从体内组织取出细胞在体外模拟体内的环境使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术
2、 原代培养:取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。    
3、 传代培养:细胞在培养器皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培养器皿中。
4、 细胞系:原代细胞**传代成功后即可成为细胞系
5、 细胞株:通过选择法或克隆法形成法从原代培养物或细胞系中获得特殊性质或标志,并保持这些特性的培养物。
6、 培养用液:培养液是维持细胞生存和生长所需的基本溶液。除培养液外,还有各种杂用液。培养用液主要分为三类:平衡盐溶液、天然培养基、合成培养基。
7、 天然培养基:在细胞培养中使用**早,也**有效,主要来自动物体液或从组织中分离提取制备的成分,其营养性较高,但成分复杂,个体差异较大,另外在来源上也有一定的限制。
8、 贴壁依赖性细胞生长时需要附着于某些带适量正电荷的固体或半固体表面,大多数动物细胞体外培养时,均以此种方式生长。
9、 合成培养基:按人和动物体内细胞所需成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。但对动物细胞来说,它也只能维持细胞的生存,要想使细胞生长和增殖,还需补充部分天然培养基,即把两者混合在一起使用,效果才更好。合成培养基的出现,促进了组织培养的发展,减少了生物个体差异的影响。
10、 平衡盐溶液BSS :是从Ringer 生理盐水发展起来的,主要由无机盐和葡萄糖组成。BSS 中的无机离子不仅是细胞生命所需成分,而且对维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面,起着重要作用。
 
二、简答题
1、细胞冻存与复苏要点与注意事项
细胞冻存要点
  (1)冷冻过程要缓慢.需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置 30-60分钟;然后转入-20℃,放置30分钟;然后再转入-80℃放置16-18小时(或过夜);**后放入液氮中长期保存.有条件的地方,可用程控降温仪,按每分钟-1 到 -3℃速度降温,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中长期保存.
  (2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90%,无微生物污染.
  (3)细胞浓度控制在:1×107-5×107/ml.
  (4)使用高浓度血清或蛋白保护剂.一般情况下,用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20%.
(5)使用合适的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,**常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜),使用终浓度为5-10%.但是,有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.因为,DMSO能诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele),羟乙基淀粉等.  
注意事项 
  (1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时,以防止冰晶过大而破坏细胞.也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中,但这样做细胞存活率要低一些.
  (2)DMSO稀释时会释放大量热量.因此,DMSO不能直接加到细胞液中,必须事先配制.
  (3)DMSO 必须是细胞培养级别的.新买的DMSO本身处于无菌状态,**次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中,4℃保存.避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质.并可减少污染机会.如要过滤DMSO,必须选用耐DMSO的尼龙滤膜. 细胞冷冻保存液主要成分:冷冻保护剂,基础培养液,血清或蛋白.
冷冻保存细胞复苏要点与注意事项:
  细胞复苏要点
(1)从液氮中取出冻存的细胞,立即放入37℃水浴中快速解冻.
  (2)将1-2ml 冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中,轻轻混匀.
  (3)用80g 离心2-3分钟,弃上清液.
  (4)用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞.
(5)接种细胞到培养瓶中,起始密度为3×105/ml.
     注意事项 
  (1)解冻时务必注意安全,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免冻伤.
  (2)冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否则,易发生污染.
  (3)快速解冻.冻存细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟).
  (4)解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.一般情况下,解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养(1ml 冻存细胞液加入到25-30ml新鲜完全培养液中),24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液,以去除DMSO.如果,细胞对冷冻保护剂特别敏感,那么,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中.
2、细胞培养基本条件
1合适的细胞培养基
  合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的**重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养 和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.