细胞培养

一、培养基的配制
a. RPMI 1640 1× (with L-glutamine) 类培养基组分:RPMI ,10%FBS(胎牛血清),双抗生素(penicillin,盘尼西林(青霉素), streptomycin,链霉素);
配制方法:500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素
b. DMEM 1× 类培养基组分: DEMI,10% FBS,双抗生素;
配制方法:500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素
 
二、培养细胞RNA的提取
1.从培养箱中拿出6孔板(每孔培养2 ml),吸出培养液;
2.PBS清洗;用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中(枪头不要触碰培养板,防止交叉污染),用1 ml枪吹匀清洗(把培养板倾斜,吸溶液指**高处打出)。重复以上操作一次。
3. 每孔中加1 ml Trizol ,吸出放-80℃冰箱冷冻。
 
三、培养细胞DNA的提取
1.从培养箱中拿出6孔板(每孔培养2 ml),吸出培养液;
2.PBS清洗;用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中(枪头不要触碰培养板,防止交叉污染),用1 ml枪吹匀清洗(把培养板倾斜,吸溶液****高处打出)。重复以上操作一次。
3. 向培养板中加酶消化(时间较长,放进培养箱,看到有白色悬浮后取出),取出加DMEM类培养基;
4. 吸出** 1.5 ml 离心管,3600 rpm,4 min离心;
5. 吸出上清(不要触及沉淀),加 PBS 1ml清洗,3600 rpm,4 min离心;
 
四、常用细胞系(人)
名称          细胞类型             来源               核型                  培养液
A431          上皮型           表皮细胞肿瘤     非整倍体(76, XX)      DMEM+10%FBS
HeLa          上皮样              宫颈癌        非整倍体(81-83,XX)     MEM+NEAA 10%FBS
Hep G2        上皮样             肝细胞癌       非整倍体(55,XY)       MEM+NEAA 10%FBS
 
MEM:极限必需培养液(Eagle);NEAA:非必需氨基酸;DMEM:Dulbecco’s MEM改良培养液;
RPMI:Roswell Park Memorial 研究所;BrdU:5-溴脱氧尿苷;APRI:腺苷磷酸核糖转移酶
实验室除snu系列与国产7721用1640培养基,其它用DMEM培养基。
五、原代培养----肝细胞
1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中,用PBS或培养液漂洗2-3次,去除血污;
2.加少量培养液,用剪子把组织剪碎,1 平方mm左右,再用吸管吹打;
3.加含10%小牛血清的1640培养液,制成均匀的细胞悬液,移入培养瓶,将组织块放在培养瓶底部,采用薄层营养液培养法,盖上瓶盖。
4.换液,只将旧的培养液吸弃,换上新的培养基。
 
六、传代培养
1.显微镜观察是否需要传代
细胞生长良好:上清液清亮,无悬浮物,折光性好,均质而透明,胞膜完整,胞内颗粒少,无空泡和脂滴。
细胞生长不良:悬浮物多,发差增大,胞膜不完整,胞质中颗粒多,出现空泡和脂滴。
 
2.贴壁细胞传代
①吸出瓶内旧培养液;
②用PBS轻缓漂洗细胞,两遍,小皿,2 ml,大皿, 4 ml,尽量弃去旧培养液(防止消化液被稀释,造成效力下降);
③向培养皿中加入适量胰蛋白酶,37℃ 2-3 min,(消化标准:细胞突起回缩,细胞间隙增大,细胞近乎圆形);
④加入一定培养液(小皿 1 ml,大皿 2 ml),终止消化反应,反复吹打贴壁细胞,制成细胞悬液;
⑤传代/弃掉, 剩余的细胞悬液加新的培养液,小皿 4-5 ml,大皿 10-12 ml;
⑥贴上细胞名称,代数,时间
 
3.悬浮细胞的传代
悬浮细胞不贴壁生长,传代时无需使用消化液处理;
悬浮细胞不贴附于支持物,胞体圆形,培养液中生长空间大,可长时间生长,便于做细胞代谢研究;
 
七、冻存细胞的复苏(提前开水浴箱37℃)
1.常用的冻存液:甘油,DMSO(二甲基亚砜,**常用,常温时对细胞有很强细胞毒作用,冻存过程中细胞代谢停止,不能发挥细胞毒作用)。
2.原则:快速融化,保证细胞外结晶在很短时间内融化,避免由于缓慢融化使水分溶入细胞内形成细胞内再结晶对细胞造成损伤;缓慢加液,加培养液时要慢,防止渗透压剧烈变化,造成细胞损伤;
加入冷的5-10倍的培养液充分稀释冻存液,以使DMSO对细胞的毒性作用降到**低点。
3.步骤:
①提前将恒温水浴箱调到37℃-42℃预热;取离心管、培养皿(酒精灯灭菌); 培养不同细胞,专管专用;
②将放在4℃冰箱平衡的细胞培养液拿出,用带有消毒水的纱布擦后放进超净台,瓶经灼烧后将盖拧松待用(避免开盖时间过长,PH改变);
③在刻度离心管中加入5-6 ml 的培养液;
④从液氮中取出冻存管,用镊子夹其盖部,在37℃温水中快速摇动,管口不要遇水;