细胞培养用液的配制具体步骤与消毒方法

 

  实验器材与生物试剂
  干粉型培养基、胰蛋白酶 ,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平 、PH计 、磁力搅拌器
  具体步骤
  一.水的制备
  细胞培养用水**非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
  二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制)
  1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4•H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶 中准确定容**1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。
  2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶,并插上针头放入高压锅内120℃消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏 水补充蒸发掉的水份。
  三.胰蛋白酶 溶液的配制与消毒
  胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清 、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的 BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清 培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
  1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平 准确称取粉剂溶入小烧杯 中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到 7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。
  2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
  四.青、链霉素溶液的配制与消毒
  1. 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。
  2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位 /瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。
  3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度**终为 100单位/ml。1单位=1微克
  五.RPMI1640的制备与消毒:
  1.溶解、调PH值、定容:先将微生物培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入微生物培养基中),充分搅拌**粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向微生物培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度**终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。**后定容**1000ml,摇匀。
  2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
  3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
  4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
  5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。